|
|
Izolace DNA z rostlinných tkání pro použití v polymerázové řetězové reakci
Trojánek, Zdeněk ; RNDr.Roman Matyášek, CSc. (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
Extrakce nukleových kyselin je důležitým krokem pro všechny molekulárně-biologické studie. Proces izolace rostlinné DNA je komplikovaný vzhledem k přítomnosti polyfenolů, polysacharidů a jiných metabolitů, které mohou být izolovány současně s DNA a působit jako inhibitory PCR. Cílem této práce bylo porovnat mezi sebou klasickou metodu izolace rostlinné DNA – metoda CTAB, komerční kit DNeasy Plant Mini Kit, přímou homogenizaci, polymerní neporezní magnetické nosiče funkcionalizované karboxylovými skupinami a kombinaci výše uvedených metod pro izolaci DNA z různých rostlin a potravin rostlinného původu. DNA izolovaná jednotlivými metodami byla hodnocena z hlediska množství, čistoty a použití v PCR. Všechny metody poskytly DNA v kvalitě vhodné pro PCR. Nicméně jednotlivé metody vykazovaly rozdíly v množství a čistotě izolované DNA, pracnosti izolace DNA a ceně. Kombinací přímé homogenizace a magnetických nosičů pokrytých karboxylovými skupinami byla izolována DNA z různých rostlin a potravin rostlinného původu v kvalitě vhodné pro konvenční PCR, PCR v reálném čase a restrikční analýzu. Tato metoda je časově nenáročná, jednoduchá a nevyžaduje práci se škodlivými látkami.
|
|
|
Mikrobiální lipázy a jejich využití
Pavlačková, Jana ; Flodrová, Dana (oponent) ; Omelková, Jiřina (vedoucí práce)
Diplomová práce je zaměřena na studium preparátu do odlučovačů tuků a odpadních potrubí, který obsahuje mikroorganismy s lipolytickou aktivitou. Teoretická část práce popisuje lipázy, mikroorganismy, které tyto enzymy produkují a využití lipáz. V této části jsou také uvedeny možnosti identifikace mikroorganismů. Praktická část se zabývá studiem komerčního přípravku Sany Duo Spezial s prokázanou přítomností mikroorganismů s lipolytickou aktivitou. U těchto mikroorganismů byla provedena identifikace metodou PCR. Pomocí této metody byly mikroorganismy identifikovány jako rod Bacillus sp. Další charakteristika přípravku byla zaměřena na stanovení hodnoty CHSKCr a výzkum vlivu různých podmínek kultivačního prostředí na produkci lipáz a jejich aktivitu. Studovaný byl vliv teploty, iontů a pH. Lipolytická aktivita byla stanovována spektrofotometricky s využitím činidla p-nitrofenyllaurátu, který se štěpí na žlutý produkt p-nitrofenol.
|
|
|
Identifikace bakterií mléčného kvašení v kysaných mléčných výrobcích s využitím amplifikačních metod
Tycová, Martina ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Polymerázová řetěžová reakce (PCR) je molekulární diagnostická metoda, která umožňuje identifikaci bakterií mléčného kvašení používaných v potravinářském průmyslu. V této práci byla použita PCR pro identifikaci bakterií druhu Streptococcus thermophilus v 10-ti náhodně vybraných komerčně dostupných kysaných mléčných výrobcích a pro identifikaci druhu Streptococcus thermophilus v 25 lyofilizátech kmenů získaných ze Sbírky mlékařských kultur Laktoflóra (CCDM, Tábor, CZ). Druhově specifické PCR primery byly cíleně vybrány z oblastí 16S rDNA. PCR produkty (968bp) byly detekovány použitím elektroforézy na 1,2 % agarózovém gelu. Bakteriální DNA byla izolována z hrubých lyzátů buněk magnetickými nosiči P(HEMA-co-GMA) obsahujícími karboxylové skupiny. DNA byla vratně navázána na jejich povrch v přítomnosti vysoce koncentrovaného polyethylenglykolu (PEG 6000) a chloridu sodného. Metoda fenolové extrakce DNA byla použita jako kontrolní. Pomocí metody PCR byly identifikovány bakterie druhu Streptococcus thermophilus ve v všech analyzovaných vzorcích.
|
|
|
The application of magnetic particles for DNA isolation from selected vegetable products
Akwari, Michala ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
Micromethod of DNA isolation using magnetic particles is one of the modern technological methods used in DNA isolation, and makes the process simpler, more effective and faster. The main aim of this study was to isolate the DNA from various plant (tomato) food products, using different types of magnetic particles. The results were compared and the quantity, purity and the possibility of amplication of the isolated DNA among samples were found to be different. The DNA isolation method using magnetic particles P(HEMA-co-GMA) or HPS B-M-NH2 was shown to be the most effective in achieving the above mentiond parametres. DNAs from the analysed samples of plant food products were isolated in sufficient quantity and quality to be used in the conventional PCR. Differences in the possibility of the amplification of the isolated DNA stored at -20 °C during more than a half year were not found.
|
|
|
Analýza DNA Lactobacillus s využitím PCR v reálném čase a HRM analýzy
Aksamitová, Dagmar ; Illková, Kateřina (oponent) ; Trachtová, Štěpánka (vedoucí práce)
K rychlé a přesné identifikaci bakterií rodu Lactobacillus, které jsou významnou součástí běžné gastrointestinální mikroflóry a fermentovaných mléčných výrobků, jsou v současné době využívány především amplifikační metody. Cílem práce bylo analyzovat možnost rozlišení vybraných bakteriálních kmenů rodu Lactobacillus pomocí metody polymerázové řetězové reakce v reálném čase v kombinaci s vysokorozlišovací analýzou křivek tání (qPCR-HRM). Celkem bylo testováno 5 primerů navržených pro qPCR HRM analýzu bakterií mléčného kvašení. Specifita použitých primerů byla současně ověřena i pomocí bioinformatické analýzy. Na základě analýzy DNA byly pro rozlišení testovaných kmenů rodu Lactobacillus jako nejvhodnější vybrány primery P1V1/P2V2, V3F/V3R a V6F/V6R. Vhodnost primerů V3F/V3R a V6F/V6R byla ověřena i na komplexním vzorku doplňku stravy, ze kterého byla DNA izolována pomocí magnetických částic. U DNA z těchto vyizolovaných buněk byla provedena vysokorozlišovací analýza křivek tání, pomocí které byla prokázána přítomnost bakterií rodu Lactobacillus. Získané výsledky se shodovaly s údaji uvedenými výrobcem.
|
|
|
Mikrobiologické analytické metody pro potřeby mlékárenského průmyslu
Vlasák, Jaroslav ; Illková, Kateřina (oponent) ; Trachtová, Štěpánka (vedoucí práce)
Teoretická část bakalářské práce je zaměřena na probiotika v mléčných výrobcích a zejména na molekulárně genetické metody využívané k analýze DNA. Pozornost je věnována především metodám stanovení bakteriálních buněk rodu Lactobacillus. Základní technikou je v současné době zejména polymerázová řetězová reakce (PCR), při které dochází k amplifikaci specifických úseků DNA pomocí krátkých oligonukleotidových primerů. V praktické části práce je izolována celková DNA z čisté bakteriální kultury a probiotického mléčného výrobku metodami fenolové extrakce a magnetické separace za využití magnetických nosičů P(GMA) pokrytých karboxylovými funkčními skupinami. Kvalita izolované DNA byla potvrzena amplifikací v PCR za použití primerů specifických pro doménu Bacteria, Lactobacillus a Biffidobacterium.
|
|
|
Analýza mikrobiálního složení vybraných probiotických výrobků metodou PCR-HRM
Tomanová, Barbora ; Španová, Alena (oponent) ; Trachtová, Štěpánka (vedoucí práce)
Práce byla zaměřena na průkaz probiotických bakterií ve čtyřech různých probiotických výrobcích (probiotický krém, probiotické tampóny, orální probiotikum a sójový nápoj s probiotiky). Byla ověřena viabilita bakterií obsažených ve výrobcích. Z komplexních matric výrobků byla izolována DNA v kvalitě vhodné pro metodu PCR s následnou identifikací deklarovaných bakteriálních rodů a druhů. K amplifikaci pomocí konvenční PCR a PCR v reálném čase byly použity rodově a druhově specifické primery. Ve výrobcích byly prokázány bakterie rodu Lactobacillus a Bacillus a bakteriální druhy Lactobacillus pentosus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentum a Lactobacillus gasseri. Následně byla testována možnost rozlišení směsi bakteriálních druhů v DNA izolované z probiotického tampónu metodou PCR-HRM. K tomu bylo testováno pět sad primerů. Jako nejvhodnější pro rozlišení byly vyhodnoceny 2 sady primerů (primery P1V1, P2V1 a V1F-HRM, V1R-HRM).
|
|
|
Magnetické nosiče a jejich praktické využití
Chlopková, Barbora ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Teoretická část shrnuje dosavadní poznatky pro praktické využití magnetických nosičů v molekulární diagnostice. Zahrnuje jak již používané metody, tak i metody s potenciálním využitím do budoucna. V experimentální části bylo testováno využití magnetických nosičů pro izolaci DNA z mléčného výrobku a bakteriální kultury. Bylo potvrzeno, že magnetickými nosiči byla izolována DNA v kvalitě a množství vhodném pro provedení polymerázové řetězové reakce.
|
|
|
Izolace DNA v kvalitě pro PCR z probiotických výrobků pro dětskou výživu
Mantlová, Gabriela ; Havlíková, Šárka (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Diplomová práce byla zaměřena na izolaci DNA v kvalitě pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR) a následnou identifikaci probiotických bakterií. Pomocí magnetických částic P(HEMA-co-GMA) byla izolována DNA v kvalitě pro PCR ze šesti probiotických preparátů vhodných jako doplňky stravy pro děti. Izolovaná DNA byla amplifikována v PCR pomocí rodově a druhově specifických primerů. Byly identifikovány následující mikroorganismy rodů Lactobacillus, Bifidobacterium a Streptococcus: L. acidophilus, L. rhamnosus, L. casei, B. bifidum, B. longum ssp. longum, B. breve, B. longum ssp. infantis, B. animalis a S. thermophilus. Tato identifikace je v souladu s údaji deklarovanými výrobci.
|
|
|
Příprava DNA v kvalitě vhodné pro polymerázovou řetězovou reakci
Čuta, Robert ; Vojtíšková, Marie (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
Bakterie mléčného kvašení (BMK) jsou ve velké míře využívány v potravinářském průmyslu například při výrobě mléčných výrobků, sýrů a fermentovaných salámů, dále se využívají ke konzervaci zeleniny. Kromě průmyslového využití jsou u BMK důležité i mikrobiologické parametry. Při identifikaci bakteriálních rodů se v poslední době velmi často využívají metody založené na izolaci a amplifikaci DNA. Diplomová práce se zabývá optimalizací lyze bakteriálních buněk rodu Lactobacillus. Jako první byla testována koncentrace lysozymu (3mg/ml, 5mg/ml, 10mg/ml) v lyzačním roztoku a doba jeho působení (3, 5 a 10 hodin). Následovalo testování lyzačních roztoků připravených z komerčních pracích prášků při lyzi bakteriálních buněk rodu Lactobacillus. K tomuto účelu byl nejprve použit prací prášek Amway o různé koncentraci (1%, 2%, 3% a 4%). Dále byly při optimalizaci testovány další čtyři druhy komerčních pracích prášků. Optimalizace lyze byla prováděna s buňkami čisté kultury různých druhů Lactobacillus.Po prověření účinnosti pracích prášků pro lyzi buněk čisté kultury Lactobacillus byly provedeny lyze buněk v potravinových matricích (Acidofilní mléko, Jogurt mango, Jogurt bílý) běžně dostupných v obchodě s potravinami. Všechny postupy byly vyhodnocovány amplifikační metodou PCR s primery specifickými pro rod Lactobacillus. Izolace DNA pro PCR byla prováděna pomocí paramagnetických nosičů P(HEMA-co-GMA) a množství DNA bylo kvantifikováno spektrofotometricky. Detekce PCR produktů byla provedena pomocí agarosové gelové elektroforézy.
|
host ::
RSS.